恶性黑色素瘤(恶黑)多发生于皮肤,恶性程度高,发展迅速,预后差,死亡率高。对放疗和化疗不敏感,临床治疗很棘手,该疾病的治疗一直困扰着医生们[1]。近年来,随着分子生物学技术的快速发展,恶黑的基因治疗也取得了长足的进展,已逐渐从单纯的基础研究过渡到临床应用,为恶黑患者带来了新的希望。
1 自杀基因导入黑色素瘤细胞
自杀基因疗法是近年发展起来的更为有效的基因治疗方法。最常用的是单纯疱疹病毒源性的胸腺嘧啶核苷激酶(ＨＳＫ ｔｋ)基因,它能把抗病毒药物更苷洛韦(ＧＣＶ)转化为一种毒性代谢物。将带有胸腺嘧啶核苷激酶基因的逆转录病毒载体选择性导入肿瘤细胞,然后加ＧＣＶ治疗,增加肿瘤细胞对ＧＣＶ的敏感性,提高抗肿瘤效应[2]。Ｋｌａｔｚｍａｎｎ等[3]设计了一个Ⅰ/Ⅱ期剂量增加的研究,用单纯疱疹病毒1型核苷激酶(ＨＳＶ 1 ｔｋ)自杀基因治疗转移性恶黑患者。在8名患者的转移性结节处直接注射含编码ＨＳＶ ｔｋ的非复制的逆转录病毒载体的鼠细胞系。7天后,又注射更苷洛韦14天。患者能耐受大剂量的ＨＳＶ 1 ｔｋ基因,仅有轻度短暂的皮肤炎性反应和发热。8名患者中有3名在注射载体的结节内观察到显著的肿瘤坏死(>50%),提示发生了更苷洛韦的直接毒性效应。该研究遇到的一个主要障碍是低转染率(小于1%),这至少可部分解释该疗法的局限性。
上述疗法还可通过“旁观者”效应杀伤未导入基因的邻近分裂细胞,显著扩大其杀伤效应。Ｂｏｎｎｅｋｏｈ[4]在一种黑色素瘤模型的315华西医学2004;19(3) ＣＮ51-1356/Ｒ
研究中证实了这种现象,因为肿瘤体积减小的程度(80%)与根据转导效率推测的程度不成比例,考虑出现了“旁观者”效应。
2 抑癌基因的治疗
临床研究最多的是ｐ53基因,该基因是人类癌症最常见的肿瘤抑制基因突变体。虽然该基因的点突变在黑色素瘤中很少见,但黑色素瘤细胞中该基因的过度表达不仅导致表达ｐ53突变体的肿瘤细胞凋亡,而且也使野生型的细胞凋亡[5]。最近,Ｄｕｍｍｅｒ等[6]评价了5名转移型黑色素瘤患者和1名乳腺癌患者肿瘤内注射野生型ｐ53腺病毒载体的生物学行为和安全性。这些患者在治疗前的活检中发现ｐ53蛋白免疫活性增加。单次注射复制缺陷型腺病毒载体可产生毒性反应。另外,肿瘤内注射两天后通过ＲＴＰＣＲ发现6名患者中有5名表现出注射的野生型ｐ53的生物学行为。在黑色素瘤以后的临床实验应确定是单独使用还是应联合其它治疗方法。
除了ｐ53,其它肿瘤抑制蛋白也是基因替代疗法的选择对象。细胞分裂和细胞周期的调控高度依赖于Ｇ1细胞周期蛋白和对细胞周期蛋白进行负调控的细胞周期蛋白依赖性激酶。导致黑色素瘤的最有特色的基因是ｐ16ＩＮＫ4ａ[7],该基因编码的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂能阻断ＣＤＫ4、ＣＤＫ6激酶的活性,从而阻断ｐＲＢ磷酸化和Ｇ1 Ｓ期的发展。Ｐ16ＩＮＫ4ａ突变体能导致ｐ16抑制功能丧失,进而导致细胞周期调控的丧失并增加肿瘤细胞的增殖潜伏期。
肿瘤的发生是多环节、多基因综合作用的结果,单一的抑癌基因常常不能完全纠正肿瘤细胞内部已发生的遗传物质的异常,因而难以达到彻底治疗的效果。ＩＮＧ1是一种抑癌基因,具有抑制细胞周期和促进凋亡的作用。Ｃｈｅｕｎｇ等[8]在恶黑细胞中转染ｐ33ＩＮＧ1、反义ｐ33ＩＮＧ1、和空载体,通过Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交证实,三者在分泌基质金属蛋白酶(ＭＭＰ)方面没有差别,ＭＭＰ具有促使肿瘤细胞扩散和内皮细胞迁移的功能。
3 癌基因信号通路的阻断
在临床前的试验中已发现很多抑制癌基因的方法。Ｐｕｔｎｅｙ等[9]使用反义寡核苷酸技术,通过给带有人黑色素瘤的ＳＣＩＤ小鼠注射ｃｍｙｃ反义寡核苷酸来定位ｃ ｍｙｃ基因,结果表明ｃ ｍｙｃ表达减少,肿瘤生长减缓、转移率低、生存率提高。
信号转导子和催化子(ＳＴＡＴ)是潜在的细胞质转录因子,除了控制细胞增殖、分化和凋亡外,还能直接导致癌基因的活化,尤以Ｓｔａｔ3明显。Ｎｉｕ等[10]近来使用一种基因治疗技术来抑制体内Ｂ16黑色素瘤细胞内活化的Ｓｔａｔ3,对小鼠进行肿瘤内注射,以阻断内源性Ｓｔａｔ3信号的表达。与注射空载体的小鼠相比,前者出现大量的肿瘤细胞凋亡。有趣的是,凋亡细胞的数量大大超出被转染的细胞数(10%～15%),提示引起了潜在的旁观者效应,因此Ｓｔａｔ3是人类黑色素瘤基因治疗的一个新的靶基因。
4 肿瘤细胞内插入基因编码的细胞因子或共刺激分子
近年来,由于细胞因子的克隆和大规模的纯化,促进了肿瘤免疫治疗的发展和应用。但由于细胞因子的半衰期短,不得不大剂量连续使用,从而导致副作用的发生。基因疗法为其应用提供了新的途径。将细胞因子导入肿瘤细胞内,再将转染了基因的瘤细胞接种到动物体内,瘤细胞分泌细胞因子通过特异或非特异的免疫反应来杀伤肿瘤。
ＤａｎａＦａｒｂｅｒ肿瘤研究中心进行了一项Ⅰ期临床实验[11],接种经自身致死量照射的黑色素瘤细胞疫苗,其能产生人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(ＧＭ ＣＳＦ)。同实验室的结果相似,21例黑色素瘤患者接种部位的组织学检查显示:Ｔ细胞、树突状细胞、巨噬细胞和嗜酸性细胞大量浸润。远距离转移灶的病理性评估揭示:接种后有密集的Ｔ细胞和浆细胞浸润。而且,在检查的16例患者中有11例发现有广泛的至少达80%的肿瘤破坏、纤维化和水肿。尽管有了这些令人鼓舞的发现,但是与目前所有的基因临床治疗相仿,即疗效是短暂的,并不能导致肿瘤的进一步缩小,而且对晚期肿瘤的作用更差。
5 遗传修饰的免疫细胞
ＡＰＣ细胞可发动免疫应答反应,以树突状细胞(ＤＣ)为基础的基因治疗的基础和临床研究是目前研究的热点。遗传性修饰ＤＣ和增强其治疗作用的方法包括脂质体转染、基因枪、基因编码的肿瘤相关性抗原和共刺激分子的病毒转染。最近,Ｋｉｋｕｃｈｉ等[12]采用了一种新的增强ＤＣ作用的方法,在ＣＤ40配基/ＣＤ40的相互作用可以启动抗原特异性Ｔ细胞应答和抑制肿瘤细胞诱导的Ｔ细胞应答的基础上,在体外用重组腺病毒载体对ＤＣ进行遗传性修饰。在Ｂ16黑色素瘤结节中注射ＣＤ40配基修饰的ＤＣ,引起了肿瘤衰退。
6 抗血管生成治疗
在肿瘤组织内往往分布着大量的新生血管,新生血管密度越高,其预后越差。这些血管呈奇异的扭曲螺旋状分布,成为癌细胞汲取营养的通道,切断这些“觅食通道”的“饥饿疗法”成为人类攻克癌症的希望[13]。目前,许多学者将反义核酸技术应用到抗肿瘤血管生成的研究中,并取的了较满意的结果。
Ｖａｌｅｓｋｙ等[14]认为晚期恶黑两个重要的生物学特征就是血管密集和高表达ｂＦＧＦ和ＦＧＦＲ 1,其利用裸鼠作为人恶黑的模型,在肿瘤内注射人源性的反义ｂＦＧＦ或ＦＧＦＲｃＤ ＮＡ目的基因,用非侵袭的动态荧光成像技术成功地观察到了恶黑细胞的凋亡和肿瘤的缩小,其机理就是阻断了肿瘤的血运,即“觅食通道”。ｂｃｌ 2/ｂｃｌ ｘｌ也是一种促血管生成因子,Ｄｅｌ等[15]在Ｃ57/Ｂ16小鼠恶黑瘤体内注射ｂｃｌ 2/ｂｃｌ ｘｌ的反义寡核苷酸,肿瘤因缺血缺氧而明显变小,而且也已应用到临床上,早期的效果尚可。
实体瘤血管形成的物质基础是内皮细胞,众多因子抑制血管生成的落脚点也是内皮细胞,已引起了人们的重视。对它的研究将继续深入,包括其产生的原因和过程,与癌基因、抑癌基因的关系,各种应用更有待进一步研究[16]。
7 基因治疗现存的缺陷
目前基因治疗所采用的载体均无定向性,全身应用带有目的基因的载体难以特异性靶向肿瘤细胞。特异性转染肿瘤细胞和避免转染正常细胞是提高疗效和减小毒性的关键。另外,若治疗的目的是控制转移,靶向多处肿瘤细胞的能力就尤为重要[17]。转移是恶黑患者治疗失败和死亡的主要原因。若没有这种特异性载体,大部分的临床实验则依赖于将基因直接导入肿瘤中。该技术的另一个难题是基因转移的效率,尤其是在灭活癌基因、导入抑癌基因或自杀基因时。
该治疗方法需要将基因导入每个肿瘤细胞中。否则,未转导的肿瘤细胞将继续增殖,导致疾病在明显的“良好的初期反应”后又继续恶化。
反义核酸技术仍具有一定缺点。人体中存在较多的ＤＮＡ酶和ＲＮＡ酶,能很快降解人工合成的反义核酸,且反义核酸种类不同,进入细胞的难易程度不同。如何增加反义核酸在体内的稳定性,是必须面对的问题。此外,反义核酸是通过竞争性抑制来对抗癌基因的表达,而不能是癌基因彻底失活,因此能否达到彻底的治疗效果尚有待进一步研究。
8 结论
恶黑的基因治疗已取得了一些实质性突破,许多基因治疗方案正处于临床试验阶段,为恶黑患者带来了新的曙光。但恶黑的病因尚不完全明了,抗恶黑的分子机制尚待进一步探讨,恶黑的防治工作仍任重而道远。但在更多学者的努力下,人类一定能攻克恶黑。
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